Le diagnostic clinique de la fièvre jaune reste difficile, car les symptômes et la sévérité de la maladie sont très variables d'un malade à l'autre. Si dans la forme classique sévère de la fièvre jaune, le tableau clinique est évocateur, les formes atténuées sont en fait prédominantes et la jaunisse est plus souvent absente que présente.

Pourtant, l'identification précoce d'un cas est très importante, car un seul cas peut annoncer une épidémie d'une ampleur imprévisible. La précocité de sa détection peut conditionner l'efficacité de la mise en oeuvre de mesures prophylactiques à l'échelle de la collectivité.

Le diagnostic positif paraclinique repose sur l'isolement du virus dans le sang par inoculation à des animaux de laboratoire (souris). Il doit être entrepris le plus précocement possible, idéalement dans les 4 premiers jours de la maladie pendant la phase où le virus se trouve dans le sang (appelée phase virémique).

Il est également possible de faire un diagnostic indirect de la maladie en détectant une ascension des anticorps antiamarils. Ils apparaissent 3 à 4 jours après le début de la maladie et persistent 2 à 3 mois.